新冠病毒的進(jìn)化速度、病毒與被感染者肺中其他微生物互動(dòng)的方式，目前尚不清楚。近日，國際學(xué)術(shù)期刊《臨床傳染病》（Clinical Infectious Diseases）刊發(fā)了來自中國研究團(tuán)隊(duì)的學(xué)術(shù)論文：新冠病毒在患者體內(nèi)的基因多樣性（Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients），聚焦了以上問題。

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)8例新冠肺炎患者，25例社區(qū)獲得性肺炎（CAP，指在醫(yī)院外罹患的肺實(shí)質(zhì)炎癥）患者和20例健康對(duì)照者的支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。研究得出在一些新冠病毒感染者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了病毒多樣性水平升高，這表明病毒存在快速進(jìn)化的風(fēng)險(xiǎn)。盡管沒有發(fā)現(xiàn)宿主內(nèi)變異（intra-host variants）傳播的證據(jù)，但也不應(yīng)忽視這種風(fēng)險(xiǎn)。

研究團(tuán)隊(duì)還表示：病毒在感染患者后會(huì)在其體內(nèi)進(jìn)化，這可能會(huì)影響病毒的毒力、傳染性和可傳播性。盡管宿主內(nèi)變異如何在人群中傳播尚不清楚，但有必要加強(qiáng)對(duì)人群中病毒進(jìn)化和相關(guān)臨床變化的監(jiān)測(cè)。

值得注意的是，患者新冠病毒基因組可能高度多樣化，這在其他病毒中也能觀察到。高多樣性可能會(huì)增加病毒種群的適應(yīng)性，使其難以消除。需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以探索這可能如何影響對(duì)病毒的免疫反應(yīng)，以及在人體或在傳播過程中是否存在對(duì)不同毒株起作用的選擇。

研究最后總結(jié)道，總的來說，這項(xiàng)研究揭示了患者體內(nèi)新冠病毒的進(jìn)化，這是大多數(shù)RNA病毒的共同特征。這些變異如何影響病毒的適應(yīng)度和群體的遺傳多樣性，有待進(jìn)一步的研究。目前，公共數(shù)據(jù)庫只共享有限的序列，因此迫切需要積累更多的序列來跟蹤病毒基因組的進(jìn)化，并將這些變化與臨床癥狀和結(jié)果聯(lián)系起來。

該論文團(tuán)隊(duì)成員來自以下單位：中國科學(xué)院北京基因組研究所；中國科學(xué)院大學(xué)；國家衛(wèi)健委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所；北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心；北京大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；廣東省新發(fā)傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)傳染國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；福建人民醫(yī)院；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院；中國科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與遺傳前沿交叉卓越創(chuàng)新中心等。論文的通訊作者為中國科學(xué)院北京基因組研究所研究員、博士生導(dǎo)師李明錕。

新冠病毒感染者體內(nèi)高水平的宿主內(nèi)變異

根據(jù)目前的數(shù)據(jù)，估計(jì)早期的新冠病毒基本傳染數(shù)（R0）在2.2到3.5之間，對(duì)公共健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。最近的研究已將蝙蝠確定為新冠病毒的可能來源，該病毒可能使用與SARS-CoV相同的細(xì)胞表面受體，即ACE2。這些研究提高了我們對(duì)新冠病毒的理解。但是，我們對(duì)新型病毒的了解仍然有限。

在人體中，新冠病毒得承受強(qiáng)大的免疫壓力，這可能令病毒不斷積累突變，從而突破免疫系統(tǒng)的控制。這些突變可能導(dǎo)致新冠病毒的毒力、傳染性和傳播性發(fā)生變化。因此，研究者們認(rèn)為必須研究突變的模式和發(fā)生的頻率。

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)8名患有新冠病毒感染者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。2019年12月24日至2020年2月9日之間收集的這110個(gè)序列研究發(fā)現(xiàn)，宿主內(nèi)變異的數(shù)量在0到51之間，中位數(shù)為4，表明該病毒的進(jìn)化速率很高。

研究團(tuán)隊(duì)總共鑒定出84個(gè)宿主內(nèi)變異，其最小等位基因頻率（MAF，通常是指在給定人群中的不常見的等位基因發(fā)生頻率）大于5％，而25個(gè)變異的MAF大于20％。

值得注意的是，變異的數(shù)量與測(cè)序深度無關(guān)。

總體Ka/Ks（異義替換（Ka）和同義替換（Ks）之間的比例，可以判斷是否有選擇壓力作用于這個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因）明顯小于1，這對(duì)于宿主內(nèi)變異和群體數(shù)據(jù)中觀察到的多態(tài)性而言是相似的，這表明：純化選擇作用于兩種類型的突變。

在基因中觀察到的變體數(shù)目與基因長(zhǎng)度成比例（對(duì)于宿主內(nèi)變異，cor＝0.950，p＝8E-06；對(duì)于多態(tài)性，cor＝0.957，p＝4E-06）。盡管在多位患者中僅觀察到一小部分變異（圖2C，84位患者中的2位），但某些位置更容易發(fā)生突變，例如位置10779，在所有7位患者中均觀察到了突變等位基因A，頻率范圍從15％到100％。

每個(gè)個(gè)體的宿主內(nèi)變異數(shù)量顯示出較大的差異（MAF≥5％的變異為0到51，中位數(shù)為4； MAF≥20％的變異為0到19，中位數(shù)為1），這不能用批次效應(yīng)、覆蓋范圍差異或污染（新冠病毒感染者一至四即nCoV1-4在一批中，新冠病毒感染者五至八即nCoV5-8在另一批中；大多數(shù)突變未在群體數(shù)據(jù)中觀察到）來解釋。研究團(tuán)隊(duì)還注意到，變異的數(shù)量與癥狀發(fā)作后的天數(shù)或患者的年齡無關(guān)。

總體而言，沒有找到導(dǎo)致新冠病毒感染者六中有極高水平變體的任何原因（51個(gè)變體）。

研究團(tuán)隊(duì)表示，需要更大的人群規(guī)模來研究此類異常值的頻率以及它們與宿主免疫反應(yīng)水平或病毒復(fù)制率是否相關(guān)。研究人員還注意到其他病毒的異常值。值得注意的是，變異的來源可能是感染后體內(nèi)發(fā)生的突變，也可能是多重傳播的新冠病毒株。

研究團(tuán)隊(duì)在討論環(huán)節(jié)提到，RNA病毒具有很高的突變率。因此，RNA病毒容易產(chǎn)生對(duì)藥物的抗性并逃避免疫監(jiān)視。新冠病毒的突變率仍不清楚。但是，這項(xiàng)研究得出新冠病毒的突變率應(yīng)與SARS-CoV處于相同的數(shù)量級(jí)。高突變率還導(dǎo)致RNA病毒中高水平的宿主內(nèi)變異。對(duì)于頻率≥5％的變異體，新冠肺炎患者的宿主內(nèi)變異體的中位數(shù)為4，該發(fā)生率與埃博拉病毒病研究中報(bào)道的發(fā)生率無明顯差異（134個(gè)樣本中頻率≥5％的655個(gè)變異體，p> 0.05），這表明新冠病毒的突變率也與埃博拉病毒相當(dāng)。

另外，此前的研究提出一種核糖核酸外切酶（ExoN）可以在SARS-CoV中提供校正活性，并且注意到該基因中的所有三個(gè)關(guān)鍵基序在SARS-CoV和新冠病毒之間是相同的。此外，在這些基序中均未檢測(cè)到多態(tài)性或宿主內(nèi)變異，表明該基因是高度保守的，因此它可能是抗病毒治療的潛在靶標(biāo)。

研究團(tuán)隊(duì)指出，盡管在多態(tài)性或宿主內(nèi)變異中均未發(fā)現(xiàn)任何突變熱點(diǎn)基因（突變幾率較高的堿基序列），但觀察到不同個(gè)體之間共有宿主內(nèi)變異，這暗示著病毒在患者體內(nèi)適應(yīng)性進(jìn)化的可能性，這可能會(huì)影響其抗原性、毒力和病毒的傳染性。

值得注意的是，患者新冠病毒基因組可能高度多樣化，這在其他病毒中也能觀察到。高多樣性可能會(huì)增加病毒種群的適應(yīng)性，使其難以消除。需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以探索這可能如何影響對(duì)病毒的免疫反應(yīng)，以及在人體或在傳播過程中是否存在對(duì)不同毒株起作用的選擇。

沒有證據(jù)表明樣品之間宿主內(nèi)部變異的傳播

在八名新冠病毒感染者中，感染者四（nCoV4）和感染者七（nCoV7）來自同一家庭，癥狀發(fā)作的日期相差五天。高度懷疑病毒由感染者四傳染給感染者七，特別是考慮到只有感染者四曾進(jìn)入武漢華南海產(chǎn)品市場(chǎng)，這是疫情暴發(fā)的起點(diǎn)，并被懷疑是新冠病毒的起源。

首先，對(duì)于兩個(gè)樣品，病毒的共有序列相同，所有四個(gè)通過感染者四選擇標(biāo)準(zhǔn)的宿主內(nèi)變異在感染者七中都沒有檢測(cè)到。研究者進(jìn)一步將研究范圍擴(kuò)大到MAF≥2％的所有變異，并得到至少3個(gè)讀段的支持。通過這樣做，研究者檢測(cè)到兩個(gè)樣本之間共有7個(gè)變異（共25個(gè)）。

但是，感染者四和感染者七中的MAF與其他樣品中的MAF相似，這表明這些位置要么容易出錯(cuò)，要么容易突變。因此它們不能支持這些變異的傳播。

同時(shí)，在所有84個(gè)宿主內(nèi)部變異中，只有3個(gè)在種群數(shù)據(jù)中是多態(tài)的（位置7866 G / T；27493 C / T；28253 C / T）。這種少量的重疊也表明宿主內(nèi)變異很少傳播給其他樣品。但是，不能排除當(dāng)前數(shù)據(jù)庫低估了種群中序列多樣性的可能性。

研究團(tuán)隊(duì)在討論中還提到，在本研究的單個(gè)傳播事件中，研究團(tuán)隊(duì)沒有發(fā)現(xiàn)多種毒株傳播的證據(jù)。然而，尚不清楚這些宿主內(nèi)變異是發(fā)生在傳播之前還是傳播之后，這也會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)論。此外，傳播可能會(huì)遇到瓶頸，這也可能導(dǎo)致多樣性的喪失。

沒有發(fā)現(xiàn)新冠患者中有任何特定的微生物群模式

除病原體外，肺部的其他微生物群，也與疾病的易感性和嚴(yán)重性有關(guān)。肺微生物群的改變可能會(huì)改變針對(duì)病毒和繼發(fā)性細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)。因此，了解包括可能引起繼發(fā)感染或?qū)︷つっ庖呦到y(tǒng)產(chǎn)生影響的細(xì)菌的微生物群，可能有助于預(yù)測(cè)并減少并發(fā)癥。

黏膜免疫系統(tǒng)，指廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺體處的淋巴組織，是執(zhí)行局部特異性免疫功能的主要場(chǎng)所。

總體來說，新冠病毒感染者、社區(qū)獲得性肺炎患者和健康組之間的微生物群組成存在顯著差異（R2=0.07，p=0.001）。

但是，某些新冠病毒感染者的樣本聚類分析表明：某些樣品的微生物群比較貧乏。除去有問題的樣本后，研究仍然發(fā)現(xiàn)新冠病毒感染者和社區(qū)獲得性肺炎患者均與健康對(duì)照組不同（新冠病毒感染者與健康組：R2=0.45，p =0.001；社區(qū)獲得性肺炎患者與健康組：R2=0.10，p=0.002），這表明他們的肺部菌群發(fā)生了微生態(tài)失調(diào)。微生物群可分為三種不同類型。特別是，群集I中的微生物群主要由可能的病原體所致，而其他群集中的微生物則更為多樣。

通過進(jìn)一步調(diào)查每個(gè)群集的種類，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，III型細(xì)菌主要是在口腔和呼吸道中經(jīng)常觀察到的共生菌，而II型細(xì)菌則主要是環(huán)境微生物，因此高度懷疑這其實(shí)是受到了污染。因此，微生物群要么富含病原體（I型），要么富含共生菌（III型），或者由于低微生物載量低而無法確定（II型）。

在所測(cè)的八個(gè)感染者中，六個(gè)新冠病毒感染者樣品中的微生物群是富含病原體的，而其他兩個(gè)樣品則富含共生菌。此外，兩個(gè)宿主內(nèi)新冠病毒變異數(shù)量過多的新冠病毒感染者樣品（感染者二、感染者六）均為富集病原體的。

論文提到，病毒的壓倒性優(yōu)勢(shì)可能與更高的復(fù)制率有關(guān)，并且還可能潛在地刺激針對(duì)該病毒的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，在這種情況下，預(yù)期會(huì)發(fā)生過多的宿主內(nèi)突變。但是，由于該分析僅包括8名新冠病毒感染者，并且絕對(duì)微生物載量尚不清楚，因此需要更多數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

研究者們討論指出，除了肺炎組的微生物多樣性明顯低于健康對(duì)照組的特點(diǎn)外，他們沒有發(fā)現(xiàn)新冠肺炎患者中有任何特定的微生物群模式，CAP患者中也沒有。一個(gè)可能的原因可能是肺炎患者使用了抗生素。然而，這并不適用于所有肺炎樣本，因?yàn)樵谝恍�樣本中發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)比例的細(xì)菌，包括2例新冠肺炎患者。

目前已知的是，病毒感染，尤其是呼吸道病毒的常見并發(fā)癥，繼發(fā)性細(xì)菌感染往往導(dǎo)致發(fā)病率顯著增加。因此，部分新冠肺炎患者BALF中細(xì)菌水平升高可能增加繼發(fā)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。在臨床資料中，新冠肺炎患者的繼發(fā)性感染率在1%-10%之間。然而，細(xì)菌相對(duì)豐度/效價(jià)與感染之間的定量關(guān)系尚不清楚。