人類大腦的神經(jīng)回路是一個(gè)極其復(fù)雜而巨大的網(wǎng)絡(luò)，包含數(shù)百億個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，這些細(xì)胞又通過數(shù)十萬億計(jì)的連接點(diǎn)（神經(jīng)突觸）交織在一起，構(gòu)成了我們思維、記憶和感情的基礎(chǔ)。如果只了解神經(jīng)回路中單個(gè)分子或單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的工作機(jī)理，而不了解多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞連接起來形成的整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和集體行為方式，是無法理解大腦復(fù)雜且高等的功能與活動(dòng)的，也無法解釋很多腦部疾病的致病機(jī)理和發(fā)展過程。

隨著科技的發(fā)展，腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的神秘面紗正逐漸被揭開。在這個(gè)過程中，各類成像方法是必不可少的手段。利用磁共振成像（MRI）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）等技術(shù)，可以在宏觀分辨率（亞毫米）下看到大腦內(nèi)部各個(gè)腦區(qū)間的連通特征。層出不窮的各種以熒光成像為主要手段的光學(xué)顯微技術(shù)，讓科學(xué)家們能夠觀察到介觀分辨率（亞微米）下單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的投射模式與神經(jīng)活動(dòng)。而最近十年間發(fā)展起來的連續(xù)斷層掃描電子顯微鏡（sSEM），使得在微觀分辨率（納米級）下獲取包含著神經(jīng)突觸連接細(xì)節(jié)的三維神經(jīng)聯(lián)接圖譜成為可能。

然而，如果把一個(gè)動(dòng)物的大腦比喻作一片廣闊森林的話，目前還沒有一項(xiàng)技術(shù)能夠同時(shí)看到整片森林中的每一棵樹（神經(jīng)細(xì)胞），并分辨清楚樹上面的每一片樹葉（神經(jīng)突觸）。

MRI、PET的分辨率太低，只能看到樹木的群落，識別不出單獨(dú)的樹木。而諸多熒光顯微成像技術(shù)雖然能夠分辨出單獨(dú)樹木，但需要對森林進(jìn)行稀疏的熒光標(biāo)記，讓其中極少比例的樹能夠發(fā)光，才能觀察到這些被“點(diǎn)亮”了的樹，而其余未點(diǎn)亮的樹木就只能是一片片觀察不到的“黑暗森林”。而且，受限于分辨率，熒光顯微成像也不能分辨出樹葉的形狀、數(shù)量和分布。連續(xù)斷層電子顯微鏡雖然能夠看清極小范圍內(nèi)的所有樹木和所有樹葉，但受限于成像速度和難以想象的龐大數(shù)據(jù)量，卻很難擴(kuò)展到觀察整片森林的規(guī)模。

為了解決這個(gè)極具挑戰(zhàn)性的問題，中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所張若冰課題組提出一種創(chuàng)新性的光學(xué)成像方法，光學(xué)多層干涉斷層成像（Optical Multilayer Interference Tomography, OMLIT），能夠在介觀分辨率下獲取腦組織中所有細(xì)胞的光學(xué)圖像，同時(shí)能與連續(xù)斷層掃描電鏡（sSEM）無縫銜接，進(jìn)一步對樣本局部區(qū)域進(jìn)行更精細(xì)的微觀分辨率成像，從而融合光、電顯微成像技術(shù)的優(yōu)勢，做到“既見森林，也見樹木，可見樹葉”。

研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)、構(gòu)造、并仔細(xì)測試了一系列多薄層結(jié)構(gòu)，包括不同基底材料、鍍層材料、鍍層厚度、超薄腦組織樣品厚度等條件，尋找到了使成像結(jié)果最為優(yōu)化的幾種多薄層結(jié)構(gòu)模式。在這些條件下，均能夠清晰地拍攝出小鼠大腦皮層組織樣品中的所有細(xì)胞，識別出神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)以及空間分布，并重建出軸突、樹突、毛細(xì)血管等形成的復(fù)雜交織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。令人驚訝的是，不同的多薄層條件可以使神經(jīng)組織顯示出對比度完全相反的圖像（圖4），說明它們并非是由于簡單的吸收或散射形成的。

研究人員建立了一個(gè)光波在不同薄層介質(zhì)間多次反射和干涉，形成超薄切片樣品中所有細(xì)胞高對比度圖像的理論模型（圖4），很好地解釋并模擬了這一成像現(xiàn)象。樣品層內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和包埋樹脂之間光學(xué)性質(zhì)具有差異，光波經(jīng)過多層薄膜的反射之后，各層反射光相疊加發(fā)生干涉，提高了生物組織與樹脂之間的明暗差異（圖5），巧妙地達(dá)到了增加對比度的效果。

OMLIT使快速重建介觀分辨率下所有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、分布和投射圖譜成為可能，并且可以無縫銜接連續(xù)斷層掃描電子顯微成像（sSEM），實(shí)現(xiàn)在同一動(dòng)物腦組織樣本上進(jìn)行全細(xì)胞光學(xué)成像和電鏡成像。通過對OMLIT圖像中局部區(qū)域的樣品進(jìn)行納米級分辨率sSEM成像，研究人員驗(yàn)證了兩種不同模態(tài)成像技術(shù)之間的兼容性，以及所重建的三維結(jié)構(gòu)之間的可融合與互補(bǔ)性（圖6）。同時(shí)，OMLIT也為sSEM提供精確的成像區(qū)域（ROI）畫界與導(dǎo)航。

該研究首次在同一個(gè)腦組織樣本中，實(shí)現(xiàn)所有細(xì)胞的介觀分辨率光學(xué)成像與微觀分辨率電鏡成像。進(jìn)一步發(fā)展并應(yīng)用OMLIT方法，我們將能夠在同一動(dòng)物大腦中解析出包含所有細(xì)胞的完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的介觀長程投射組圖譜（Projectome），并且在選定的重點(diǎn)區(qū)域，通過銜接sSEM，繪制出完整的微觀本地聯(lián)接組圖譜（Connectome），鑲嵌入介觀長程投射譜的背景中。并且，OMLIT的腦樣品庫可以很方便地長期保存，能夠隨時(shí)選擇繪制其他區(qū)域的微觀神經(jīng)聯(lián)接組圖譜。

在當(dāng)前成像技術(shù)和圖像處理能力的制約下，由于過于巨大的時(shí)間消耗和數(shù)據(jù)量，單純使用sSEM繪制全域的微觀分辨率神經(jīng)聯(lián)接組圖譜是不現(xiàn)實(shí)的。而利用OMLIT銜接sSEM繪制同一動(dòng)物的全域介觀＋局域微觀融合腦圖譜是一條非�？尚械穆肪�。全細(xì)胞介-微觀融合腦圖譜將能夠提供腦神經(jīng)回路在不同尺度下的空間與結(jié)構(gòu)特征，幫助解析神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不同層級的結(jié)構(gòu)基元和交聯(lián)規(guī)律，預(yù)期將推動(dòng)基于自然智能構(gòu)造新一代人工智能的進(jìn)步。

相關(guān)成果已經(jīng)以 Optical Multilayer Interference Tomography Compatible with Tape-Based Serial SEM for Mesoscale Neuroanatomy 為題在線發(fā)表在ACS Photonics上，并選為補(bǔ)充期刊封面。

論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsphotonics.1c00892

來源：中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所