2016年12月1日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心高寧課題組和合作者在《Nature》在線發(fā)表題為Mechanistic insights into the alternative translation termination by ArfA and RF2的研究論文。該論文報(bào)道了大腸桿菌中non-stop mRNA在核糖體上的翻譯終止?fàn)顟B(tài)復(fù)合物的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并揭示了ArfA在non-stop mRNA翻譯終止過程中的作用機(jī)制。

核糖體上的蛋白翻譯是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包括翻譯起始、延伸和終止等多步嚴(yán)密調(diào)控的步驟。在細(xì)菌中，當(dāng)?shù)鞍追�譯進(jìn)行到mRNA上的終止密碼子時(shí)，翻譯終止因子RF1或RF2可以直接識(shí)別終止密碼子，結(jié)合到核糖體上的活性中心，催化釋放共價(jià)偶聯(lián)在肽酰tRNA 3’末端上的新生肽鏈，這個(gè)過程受RF1/RF2上保守的催化活性基序Gly-Gly-Gln（GGQ）序列的調(diào)控。在細(xì)胞中，由于轉(zhuǎn)錄提前終止、mRNA錯(cuò)誤加工、藥物或者物理損傷等會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中產(chǎn)生缺少終止密碼子的mRNA，這類mRNA被稱為non-stop mRNA。當(dāng)核糖體移動(dòng)到non-stop mRNA的3’末端時(shí)，由于缺少終止密碼子對RF1/RF2的激活作用，核糖體會(huì)停滯在mRNA的3’末端并且不能夠進(jìn)行正常的翻譯終止。細(xì)胞中積累過多停滯的核糖體會(huì)產(chǎn)生毒性，真核生物和原核生物都進(jìn)化出了相應(yīng)的質(zhì)量控制體系來回收這些核糖體。在細(xì)菌中，一類針對non-stop mRNA的挽救系統(tǒng)依賴于一種小蛋白ArfA（alternative ribosome rescue factor A）�，F(xiàn)有的少量遺傳和生化數(shù)據(jù)表明，當(dāng)核糖體停滯在non-stop mRNA的3’末端時(shí)，ArfA結(jié)合到核糖體上的解碼活性中心，招募并激活RF2的肽酰水解活性，從而釋放新生肽鏈。然而，眾多機(jī)制相關(guān)的問題尚不清楚，例如ArfA是如何激活RF2的水解功能？ArfA如何區(qū)分不同長度mRNA結(jié)合的核糖體？

高寧課題組在體外組裝了ArfA/RF2、non-stop mRNA、tRNA與70S核糖體的復(fù)合物，并獲得了該復(fù)合物的高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（3埃分辨率，核心區(qū)域接近2.6埃）。結(jié)構(gòu)表明ArfA C端的loop結(jié)合于核糖體30S小亞基上的mRNA進(jìn)入通道，并部分地占據(jù)了終止密碼子的結(jié)合位點(diǎn)，而N端則直接與30S解碼中心及RF2相互作用。進(jìn)一步的分析表明ArfA扮演了兩個(gè)重要的角色：其N端作為mRNA長度的感受器（Sensor），如果核糖體尚未行進(jìn)到mRNA的3’末端，mRNA進(jìn)入通道內(nèi)的核苷酸會(huì)阻礙ArfA的結(jié)合；其C端則通過和RF2直接結(jié)合，從功能上補(bǔ)償了終止密碼子對RF2的激活效應(yīng)。

這項(xiàng)研究展示了自然界的一種奇妙的功能模擬機(jī)制：具有極大結(jié)構(gòu)柔性的小蛋白可以通過結(jié)構(gòu)模擬來取代mRNA上的三堿基終止密碼子的功能。值得一提的是，在這項(xiàng)工作發(fā)表的同一天，Nature和Science同時(shí)在線發(fā)表了來自德國（慕尼黑大學(xué)Wilson實(shí)驗(yàn)室）和英國（MRC Ramakrishnan實(shí)驗(yàn)室，2009 Nobel化學(xué)獎(jiǎng)）科學(xué)家的相似的工作。

圖：ArfA在核糖體上的結(jié)合位點(diǎn)

高寧研究組的博士生馬成英和日本弘前大學(xué)（Hirosaki University）的Daisuke Kurita博士為該論文的共同第一作者。高寧和Hyouta Himeno教授為共同通訊作者。高寧研究組成員李寧寧和陳燕也參與了本課題的研究。冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集得到了國家蛋白質(zhì)科學(xué)設(shè)施（北京）的清華大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)支持，數(shù)據(jù)處理得到國家蛋白質(zhì)科學(xué)設(shè)施（北京）清華大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)的支持。部分計(jì)算處理也得到了了北京大學(xué)生命聯(lián)合中心高性能計(jì)算平臺(tái)的支持。本工作獲得清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、教育部蛋白質(zhì)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、科技部重大科學(xué)研究計(jì)劃專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金委等的經(jīng)費(fèi)支持。

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